Jak przeprowadzić analizę metodą PCR: opis procedury

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest znana od 30 lat. Jest szeroko stosowany w wielu dziedzinach, od archeologii po genetykę.

Jest to metoda PCR, która pomaga ustalić ojcostwo, ale najczęściej jest wykorzystywana do identyfikacji różnych chorób zakaźnych w organizmie człowieka.

Jak przebiega analiza PCR i co to jest? Spróbujemy szczegółowo odpowiedzieć na te pytania.

Analiza PCR - co to jest?

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest wysoce precyzyjną metodą diagnostyki genetycznej molekularnej, która umożliwia wykrywanie różnych chorób zakaźnych i dziedzicznych u ludzi, zarówno w ostrych, jak i przewlekłych stadiach, i na długo przed wystąpieniem choroby.

Metoda PCR jest absolutnie specyficzna i przeprowadzona prawidłowo nie może dać fałszywie pozytywnego wyniku. Oznacza to, że jeśli nie ma infekcji, analiza nigdy nie pokaże, co to jest. Dlatego bardzo często do zatwierdzenia diagnozy podejmuje się dodatkową analizę PCR w celu określenia czynnika sprawczego i jego charakteru.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w 1983 r., Opracowana przez Carey Mulllis (USA), za którą w 1993 r. Otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Jaka jest zaleta tej metody?

Diagnoza tą metodą pozwala znaleźć patogen bezpośrednio w genie zawartym w badanych materiałach. Jest to najdokładniejsza analiza infekcji narządów płciowych, ukrytych infekcji, różnych chorób przenoszonych drogą płciową.

Różnice w diagnostyce PCR z innych metod badań laboratoryjnych są następujące:

• metoda ma na celu identyfikację samego patogenu;
• Diagnostyka PCR jest uniwersalna: do wykrywania kilku patogenów;
• choroby, wystarczy jedna próbka biologiczna pacjenta;
• metoda jest bardzo czuła i nie towarzyszą jej inne reakcje krzyżowe.

Ponadto zaletą diagnostyki PCR jest to, że każdy materiał biologiczny pacjenta nadaje się do analizy: krew, wydzielina z narządów płciowych, mocz, nasienie.

Jakie infekcje mogą ujawnić rozmaz po PCR?

W organizmie może występować duża liczba patogenów, w tym „ukryte”, które nie przejawiają się przez długi czas.

Analiza wymazu metodą PCR pozwala ujawnić takie infekcje:

Materiałem testowym do PCR jest zwykle plwocina, ślina, mocz i krew. Przed analizą musisz się do niej starannie przygotować, po wcześniejszej konsultacji z lekarzem.

Krew do PCR jest zwykle podawana na pusty żołądek. Dobre wyniki pokazują analizę, kiedy materiał do badania jest pobierany z kanału szyjki macicy lub cewki moczowej. W takim przypadku najlepiej jest przeprowadzić diagnostykę PCR nie później niż jeden dzień po stosunku.

Odmiany PCR

PCR stosuje się w wielu obszarach do analizy i eksperymentów naukowych. Istnieją różne metody analizy:

1. PCR z odwrotną transkrypcją (PCR z odwrotną transkrypcją, RT-PCR (angielski)) stosuje się do amplifikacji, izolacji lub identyfikacji znanej sekwencji z biblioteki RNA.
2. Odwrócona PCR (Inverse PCR (Eng.)) - jest stosowana, jeśli tylko mała część jest znana w pożądanej sekwencji. Ta metoda jest szczególnie przydatna, gdy konieczne jest określenie sąsiednich sekwencji po wstawieniu DNA do genomu.
3. Zagnieżdżona PCR (Nested PCR) jest stosowana w celu zmniejszenia liczby produktów ubocznych reakcji. Stosuje się dwie pary starterów i przeprowadza się dwie kolejne reakcje.
4. Asymetryczna PCR (Asymetryczna PCR) jest przeprowadzana, gdy konieczne jest amplifikowanie głównie jednego z łańcuchów oryginalnego DNA. Używany w niektórych testach sekwencjonowania i hybrydyzacji.
5. Ilościowa PCR (ilościowa PCR, Q-PCR (ang.)) Lub PCR w czasie rzeczywistym jest stosowana do bezpośredniego monitorowania pomiaru ilości specyficznego produktu PCR w każdym cyklu reakcji.
6. Etap PCR (Touchdown PCR (Eng.)) - zastosowanie tego podejścia zmniejsza efekt niespecyficznego wiązania starterów.
7. PCR specyficzny dla grup (PCR specyficzna dla grupy) - PCR dla powiązanych sekwencji w obrębie jednego lub pomiędzy różnymi gatunkami, z zastosowaniem konserwatywnych starterów dla tych sekwencji.

Jeśli sekwencja nukleotydowa macierzy jest częściowo lub nieznana, możliwe jest użycie zdegenerowanych starterów, których sekwencja zawiera zdegenerowane pozycje, w których można zlokalizować dowolne zasady. Na przykład sekwencją startera może być:... ATH..., gdzie H to A, T lub C.

Jakie materiały biologiczne są badane?

Materiał do badań PCR, w którym można wykryć obce bakteryjne DNA lub DNA lub RNA wirusa, może składać się z różnych mediów biologicznych i płynów ludzkich:

1. Mocz. Może być stosowany do infekcji dróg moczowo-płciowych u mężczyzn i narządów moczowych u kobiet (u mężczyzn, stosowanie moczu jako materiału zastępuje skrobanie nabłonka).
2. Flegma. Służy do diagnozowania gruźlicy i rzadziej do diagnozowania postaci oddechowych chlamydii i mykoplazmozy. Plwocinę w ilości 15-20 ml zbiera się w sterylnej (jednorazowej) butelce.
3. Płyny biologiczne. Sok prostaty, opłucnowy, mózgowo-rdzeniowy, owodniowy, płyn stawowy, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, ślina są przyjmowane zgodnie ze wskazaniami.
4. Skrawki nabłonkowe z błon śluzowych. Powszechnie stosowany do diagnozowania chorób przenoszonych drogą płciową (STD), takich jak rzeżączka, chlamydia, mykoplazmoza, ureaplazmoza, rzęsistkowica, gardnerellezis, opryszczka i inne infekcje, które dotykają błon śluzowych.
5. Biopsje. Najczęściej używane biopsje żołądka i dwunastnicy w celu identyfikacji zakażenia Helicobacter pylori.
6. Krew, osocze, surowica. Używany do analizy PCR wirusów zapalenia wątroby typu B, C, D, G, opryszczki, wirusa CMV, HIV, ludzkich genów.

Jak przygotować się do analizy?

Wiarygodność wyniku PCR zależy bezpośrednio od poprawności dostarczenia materiału do badania. Materiał nie powinien być zanieczyszczony, w przeciwnym razie wynik badania nie będzie obiektywny. Najważniejszymi zaleceniami przed złożeniem analizy PCR są następujące wymagania:

1. Mocz jest dostarczany rano w sterylnym pojemniku.
2. Badanie krwi na zakażenie należy wykonać rano na pusty żołądek.
3. Nie ma potrzeby pokazywania aktywności seksualnej na dzień przed analizą.

Wynik analizy będzie gotowy w ciągu 1,5-2 dni po zabiegu. Są takie sytuacje, gdy wynik można przygotować tego samego dnia.

Dekodowanie analizy CRP

Proces interpretacji prezentowanych badań wyróżnia się prostotą. Wyniki analizy PCR można uzyskać w ciągu 1,5-2 dni po dostarczeniu materiału. W niektórych przypadkach wynik jest gotowy już pierwszego dnia i może to oznaczać:

• Wynik negatywny wskazuje, że w diagnozowanym materiale brakuje czynnika zakaźnego.
• Pcr pozytywny oznacza, że ​​DNA lub RNA patogenu jest obecny w ludzkim ciele.

W niektórych przypadkach należy uzyskać ilościowe oznaczenie mikroorganizmów. Dotyczy to szczególnie chorób wywoływanych przez mikroorganizmy oportunistyczne. Ponieważ bakterie te wykazują negatywny wpływ tylko z nadmiernymi ilościami.

Również ilościowa analiza PCR jest ważna dla wyboru taktyk terapeutycznych i kontroli leczenia infekcji wirusowych, takich jak HIV i wirusy zapalenia wątroby.

Jak dokładna jest diagnostyka zakażeń metodą PCR?

Metoda PCR charakteryzuje się wysoką dokładnością, specyficznością i czułością. Oznacza to, że ta analiza jest w stanie:

• dokładnie określić obecność lub brak infekcji;
• określ dokładnie, jaki rodzaj infekcji (swoistość);
• wykryć infekcję nawet przy bardzo niskiej zawartości DNA drobnoustrojów w materiale biologicznym,
• który został poddany badaniom (czułość).

Analiza PCR: cena i czas

Cena konkretnej analizy zależeć będzie od tego, na którą infekcję jesteś sprawdzany. Przybliżone ceny i warunki:

1. STI: 300-500 rubli, czas - 1 dzień;
2. Wirus Epsteina-Barra, wirus brodawczaka ludzkiego, wirus opryszczki, wirus cytomegalii: 300-500 rubli, terminy - 1 dzień;
3. Wirusowe zapalenie wątroby typu A, B, C, D, G: analiza jakościowa 650 rubli, analiza ilościowa 2000 rubli. Warunki - do 5 dni;
4. Przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C, całkowite (Anti-HCV) - 420 rubli;
5. Przeciwciała przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C, IgM (anty-HCV IgM) - 420 rubli;
6. Helicobacter pylori (Helicobacter pylori): 300-400 rubli, terminy - 1 dzień;
7. HIV (przeciwciała i antygeny) - 380 rubli;
8. RNA RNA jakościowo - 3500 rubli;
9. RNA RNA, ilościowo - 11 000 rubli.

Aby zaoszczędzić pieniądze, możesz wybrać stałą partię analiz. Usługa ta jest świadczona przez większość klinik, w których można przejść analizę metodą ERP (invitro, onclinics itp.).

Diagnostyka PCR gruźlicy

Gruźlica jest swoistą infekcją, jej uwaga może tkwić w ludzkich tkankach przez lata, a następnie rozprzestrzeniać się przez kilka miesięcy. Jest to choroba przewlekła, której optymalne schematy leczenia są trudne do wybrania. Jednym z powodów jest późna diagnoza, kiedy mykobakterie, będąc w organizmie ludzkim, już przystosowały się do wielu leków.

Jakie istnieją nowoczesne metody diagnozy? Diagnostyka PCR - co to jest? Jak to się robi? W jakich przypadkach diagnozuje się gruźlicę tą metodą i jaka jest jej istota?

Czym jest diagnostyka PCR

Jest to jedna z najnowocześniejszych metod diagnozowania nie tylko chorób, ale także wykrywania materiału biologicznego. Diagnostyka PCR została wynaleziona stosunkowo niedawno. Około 30 lat temu w 1983 roku amerykański biochemik Carey Banks Mullis zaproponował złożony schemat odzyskiwania materiału biologicznego mikroorganizmów w jednym krótkim segmencie. Dzięki jego odkryciu naukowiec otrzymał najwyższą nagrodę - Nagrodę Nobla.

Co to jest - diagnostyka zakażeń metodą PCR? Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest diagnozą wykrywania chorób wirusowych w oparciu o metody inżynierii genetycznej. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii medycznej, immunologii i wirusologii. Metoda jest uniwersalna i pomaga w postawieniu diagnozy przy niewielkiej ilości materiału. Zakażenie można wykryć dosłownie w pierwszych godzinach zakażenia, na długo przed pojawieniem się pierwszych objawów choroby.

Metoda polega na pozyskiwaniu z materiału od chorej osoby nie samego patogenu, ale fragmenty genomu (cząsteczki DNA), jego biosynteza z późniejszym określeniem, do której klasy mikroorganizmów należy uzyskany materiał genetyczny za pomocą metod genetyki molekularnej.

Pomimo faktu, że jest to złożony proces, zajmuje znacznie mniej czasu niż wiele biologicznych metod wykrywania czynników zakaźnych. W ciągu zaledwie kilku godzin mikroorganizm można wykryć metodą PCR. Aby to zrobić, nie ma potrzeby izolowania go od środowiska (krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, plwociny) i hodowania go przez długi czas na pożywkach sztucznych. Wystarczy, że w badanym materiale obecny jest mały fragment nici DNA czynnika zakaźnego.

Podstawą reakcji jest możliwość wytworzenia w sztucznych warunkach (in vitro) syntezy cząsteczek kwasu nukleinowego czynnika zakaźnego.

Co jest potrzebne do PCR?

1. Startery to segmenty DNA, z których rozpoczyna się biosynteza lub tworzenie.
2. Nukleotydy lub złożone związki będące podstawą cząsteczki DNA lub RNA.
3. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest niemożliwa bez obecności polimerazy, która jest enzymem przyspieszającym PCR.

Etapy diagnostyki PCR

Jak przeprowadza się diagnostykę molekularną metodą PCR? Procedura jest prosta i zajmuje krótki czas, biorąc pod uwagę zbiór materiałów.

1. Przed rozpoczęciem badania pobierają niezbędny materiał biologiczny - jest to woda do przemywania oskrzeli, krew, zawartość żołądka, plwocina. Rodzaj materiału biologicznego zależy od podejrzewanego patogenu.
2. Denaturacja lub zniszczenie podstawowej struktury DNA, która składa się z dwóch łańcuchów. Istotą tego etapu jest oddzielenie dwóch łańcuchów pod wpływem wysokiej temperatury (maksimum wynosi 98 ° C, co trwa nie dłużej niż dwie minuty).
3. Na następnym etapie PCR, zwanym wygrzewaniem, temperatura jest zmniejszana o kilka stopni, tak że starter będzie wiązał się z nicią DNA.
4. Wydłużenie, podczas którego synteza pożądanych cząsteczek zachodzi bezpośrednio.

W rezultacie tylko 25-30 takich cykli otrzymuje niezbędną liczbę kopii DNA mikroorganizmu, które są łatwe do rozpoznania.

Czy PCR wymaga diagnozy gruźlicy?

Absolutnie wszyscy ludzie z podejrzeniem gruźlicy nie mogą przeprowadzić PCR, ponieważ metoda wymaga drogiego sprzętu. Nie wszystkie kliniki publiczne mogą sobie pozwolić na jego zakup. Ponadto zdarzyło się tak, że zwykłe metody diagnozowania zakażenia w większości przypadków również się usprawiedliwiają.

Obejmują one:

• badanie pacjenta, przyjmowanie historii;
• pełne badanie osoby;
• badanie z użyciem testu tuberkulinowego Mantoux;
• radiografia lub fluorografia;
• diagnostyka komputerowa w razie potrzeby;
• metody badań mikrobiologicznych: mikroskopia rozmazowa i badanie bakteriologiczne plwociny.

PCR dla gruźlicy przeprowadza się w szczególnych przypadkach, gdy trudno jest postawić diagnozę lub nie jest możliwe przeprowadzenie innych metod instrumentalnych.

Pomimo obfitości metod diagnostycznych częstość występowania gruźlicy stale rośnie. Obecnie istnieje nie tylko jego wzrost, ale także inne funkcje:

• choroba często występuje w ciężkiej postaci;
• liczba śmiertelnych przypadków wzrasta;
• coraz bardziej odporne na nowoczesną chemioterapię są zdiagnozowane formy choroby.

Niechęć samych ludzi do corocznego przechodzenia rutynowych badań lekarskich, odrzucenie szczepień prowadzi do rozprzestrzeniania się gruźlicy. W takich warunkach potrzebujemy szybkich, informacyjnych i skutecznych metod badawczych, które powinny być dostępne dla dzieci i dorosłych. Wszystkie powyższe metody diagnostyczne są znacznie gorsze od PCR.

Zalety diagnozowania gruźlicy metodą PCR

Badania te, choć nowe, dobrze się sprawdziły, szczególnie w kontrowersyjnych przypadkach, w których nie można postawić diagnozy z wielu powodów.

Dzięki PCR znacznie łatwiej jest wykryć czynnik sprawczy gruźlicy w badanym materiale.

Zalety diagnostyki PCR są następujące.

1. To szybka analiza. Niewielki fragment cząsteczki DNA można wykorzystać do diagnozowania w ciągu zaledwie kilku godzin (około pięciu), co z powodzeniem stosuje się w sytuacjach awaryjnych, gdy na przykład przed operacją konieczne jest ustalenie, czy dana osoba jest chora na gruźlicę.
2. Analiza PCR jest dozwolona w przypadku, gdy inne metody są niedostępne lub zabronione (w celu wykrycia gruźlicy płuc, czasami trzeba wykonać kilka zdjęć radiograficznych, co będzie dużą dawką promieniowania).
3. Za pomocą PCR bada się każde środowisko biologiczne pod kątem obecności w nim patogenu. Na przykład można przeprowadzić badanie płynu mózgowo-rdzeniowego, jeśli istnieje podejrzenie gruźliczego zapalenia opon mózgowych.
4. Dozwolona diagnostyka PCR chorób zakaźnych u dzieci, ponieważ metoda jest bezpieczna.
5. Pozwala zidentyfikować patogen na dowolnym etapie choroby.
6. Wysoka czułość PCR umożliwia wykrycie Mycobacterium tuberculosis, nawet jeśli w materiale biologicznym jest tylko kilka drobnoustrojów.
7. Dobrze jest przeprowadzić diagnozę nawrotu choroby.

Przecież odczyt PCR wydaje się niemal doskonałą metodą diagnostyczną, która powinna wzbudzić podejrzenie gruźlicy u wszystkich. Ale są też wady, należy je wziąć pod uwagę.

Wady PCR w diagnostyce gruźlicy

W naszych czasach taka diagnostyka jest rzadsza niż regularność. I dlatego jest powód.

1. To droga metoda badawcza. W wielu klinikach sprzęt do PCR jest nieobecny ze względu na jego wysoki koszt, ale nadal można przeprowadzać analizy w płatnych laboratoriach.
2. Natychmiast po zabiegu martwe prątki lub żyjące w małych ilościach mogą nadal być obecne w organizmie ludzkim (wynik będzie pozytywny podczas diagnostyki PCR), więc metoda będzie niewiarygodna w tym czasie, nie ma sensu jej przeprowadzać.
3. Mutacje prątków powodują nieskuteczną reakcję PCR - normalna sekwencja nici DNA nie może zostać zsyntetyzowana.
4. Konieczne jest wybranie odpowiedniego środowiska do badania, krew pobierana jest tylko wtedy, gdy podejrzewa się, że jest zakażona (posocznica), nie ma potrzeby przyjmowania plwociny, jeśli istnieje problem gruźlicy narządów układu nerwowego. W tym przypadku PCR nie będzie w stanie wykryć patogenu, a diagnoza będzie niedoinformowana.

Wskazania do wykrywania gruźlicy za pomocą analizy PCR

Diagnoza PCR gruźlicy jest przeprowadzana najczęściej w kontrowersyjnych przypadkach. Kiedy lekarze kierują to badanie?

1. Jeśli trudno jest postawić diagnozę przy użyciu zwykłych dostępnych metod, ale był kontakt z pacjentem z gruźlicą.
2. W przypadku, gdy dana osoba nie może zostać dostarczona do kliniki, aby poddać się rutynowym rutynowym testom na gruźlicę, łatwiej jest ją zbadać za pomocą PCR, ponieważ plwocina do testu może zostać dostarczona do słoika, a diagnoza zostanie potwierdzona w ciągu kilku godzin.
3. Jeśli dana osoba będzie miała operację ratunkową i pilnie trzeba się dowiedzieć, czy jest chora na gruźlicę.
4. Jeśli to konieczne, kobieta w ciąży jest również lepiej zbadać na gruźlicę za pomocą PCR, ponieważ metoda jest bezpieczna.
5. Na zasadzie płatnej każdy, kto nie został zdiagnozowany z gruźlicą, został potwierdzony metodami bakteriologicznymi i fluoroskopią. Dzieje się tak, gdy uszkodzenie w płucach jest niezauważalne w bezpośrednim obrazie, a osoba podczas dostarczania plwociny do badania nie może zastosować się do zaleceń dotyczących prawidłowego pobrania materiału. W tym przypadku osoba obawia się wszystkich objawów charakterystycznych dla gruźlicy płucnej.
6. Kiedy pojawiają się wątpliwości co do wyników testu Mantoux.
7. Zaleca się przeprowadzenie diagnostyki gruźlicy metodą PCR u dzieci. Procedura jest bezpieczna, nie powoduje dodatkowej ekspozycji na promieniowanie i jest skuteczna w wykrywaniu trudnych do zdiagnozowania form choroby.

Terminowa diagnoza gruźlicy jest kluczem do właściwie przepisanego leczenia i zmniejszenia rozprzestrzeniania się choroby. Często znane metody wykrywania chorób nie zawsze są skuteczne. Dlatego dzisiaj PCR jest jednym z najbardziej niezawodnych i bezpiecznych sposobów wykrywania infekcji we wczesnych stadiach rozwoju.

Analiza PCR

PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) jest zdecydowanie najszybszą i najbardziej niezawodną metodą diagnozowania chorób zakaźnych.

Zasada metody reakcji łańcuchowej polimerazy została opracowana przez Kary'ego Mullisa w 1983 r. Do jego odkrycia K. Mullis w 1993 r. Otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Metoda PCR pozwala uzyskać znaczny wzrost małych stężeń niektórych fragmentów kwasu nukleinowego (DNA) w materiale biologicznym (próbce). Metoda opiera się na wielokrotnym selektywnym kopiowaniu (amplifikacji) pewnej części DNA przy użyciu enzymów w sztucznych warunkach.

Zalety metody diagnostycznej PCR jako metody diagnostycznej chorób zakaźnych

Bezpośrednie wykrywanie patogenów

Wiele tradycyjnych metod diagnostycznych, takich jak enzymatyczny test immunologiczny, wykrywa markery białkowe, które są produktami aktywności życiowej czynników zakaźnych, co daje tylko pośrednie dowody na obecność infekcji. Identyfikacja określonego regionu DNA patogenu metodą PCR daje bezpośrednie wskazanie obecności patogenu.

Wysoka specyficzność

Wysoka specyficzność metody PCR wynika z faktu, że w badanym materiale wykrywany jest unikalny fragment DNA. Swoistość jest określona przez sekwencję nukleotydową starterów, co wyklucza możliwość uzyskania fałszywych wyników, w przeciwieństwie do immunologicznych metod analizy, w których często występują błędy związane z reagującymi krzyżowo antygenami.

Wysoka czułość

Metoda PCR pozwala wykryć nawet pojedyncze komórki bakterii lub wirusów. Analiza PCR ujawnia obecność patogenów chorób zakaźnych w przypadkach, gdy inne metody (immunologiczne, bakteriologiczne, mikroskopowe) nie mogą tego zrobić. Czułość analizy PCR wynosi 10-100 komórek na próbkę (czułość testów immunologicznych i mikroskopowych wynosi 103-105 komórek).

Uniwersalność procedury wykrywania różnych patogenów

Materiałem do badań metodą PCR jest DNA patogenu. Metoda opiera się na wykrywaniu fragmentu DNA lub RNA specyficznego dla danego organizmu. Podobieństwo składu chemicznego wszystkich kwasów nukleinowych pozwala na stosowanie jednolitych metod badań laboratoryjnych. Umożliwia to zdiagnozowanie kilku patogenów z pojedynczego testu biologicznego.

Wysoki wskaźnik wyników analizy

Do analizy PCR nie jest wymagana izolacja i hodowla patogenu, co zajmuje dużo czasu. Ujednolicona metoda przetwarzania biomateriału i wykrywania produktów reakcji oraz automatyzacja procesu amplifikacji umożliwiają przeprowadzenie pełnej analizy w ciągu 4-5 godzin.

Zdolność do diagnozowania nie tylko ostrych, ale także utajonych infekcji

Metoda PCR jest szczególnie skuteczna w diagnozowaniu trudnych w uprawie, nieuprawnych i trwałych form mikroorganizmów, które często występują w infekcjach utajonych i przewlekłych, ponieważ metoda ta pozwala uniknąć trudności związanych z hodowlą takich mikroorganizmów w laboratorium. Zastosowanie diagnostyki PCR jest również bardzo skuteczne przeciwko patogenom o dużej zmienności antygenowej i pasożytom wewnątrzkomórkowym.

Jak skuteczne jest badanie plwociny w przypadku gruźlicy metodą PCR?

Aby zidentyfikować pałeczki Kocha u ludzi, stosuje się różne metody diagnostyczne. Dzięki niemu patologię można wykryć nawet na początkowym etapie, co zwiększa szanse pacjenta na wyzdrowienie. Analiza plwociny dla gruźlicy jest techniką, która jest najbardziej ceniona i jest dość skuteczna. Co to jest i ile kosztuje taka analiza?

Jaka jest analiza plwociny metodą PCR?

PCR oznacza reakcję łańcuchową polimerazy. Ta metoda jest skuteczna przeciwko chorobom zakaźnym. Aby ustalić jasną diagnozę, nie trzeba zbierać dużej ilości biomateriałów i długo czekać, jak w przypadku siewu plwociny.

Metoda opiera się na uzyskaniu DNA cząstek mikroorganizmów. Ponadto badania genetyczne molekularne określą, jaki rodzaj mikroorganizmów powinien zawierać dostępny materiał. W warunkach probówki specjalista syntetyzuje cząsteczki bakterii i wyciąga odpowiednie wnioski w ciągu kilku godzin.

Skuteczność

Analiza plwociny dla Mycobacterium tuberculosis jest skuteczna, gdy różdżka Kocha uderzyła w układ oddechowy. W tym przypadku chorobę można łatwo zidentyfikować, nawet w pierwszych godzinach infekcji.

Jednak analiza plwociny nie pokaże wiarygodnego wyniku, jeśli gruźlica jest obecna:

• kości;
• mózg, rdzeń kręgowy;
• układ nerwowy;
• stawy itp.

Fisiatra będzie w stanie określić rodzaj choroby, biorąc pod uwagę obecne objawy i opierając się na wynikach ogólnych i innych analiz.

Niewłaściwe jest również takie badanie w przypadku, gdy trzeba przeprowadzić analizę kontrolną po leczeniu choroby. Wynik będzie pozytywny, tak jak w ciele, w każdym razie nadal istnieją żywe lub martwe IBC. Lepiej jest preferować inną procedurę diagnostyczną.

Przeciwwskazania do metody

W związku z tym nie ma przeciwwskazań do badania plwociny w przypadku gruźlicy za pomocą PCR. Istnieją ograniczenia. Jak wspomniano powyżej, nie ma potrzeby przeprowadzania go po leczeniu gruźlicy. Wyniki nie będą przydatne. W tym przypadku pożądane jest zastosowanie innej diagnozy.

Ponadto nie ma innych przeszkód dla tej diagnozy. Plwocinę można badać w każdej kategorii wiekowej i w przypadku chorób powiązanych. Nawet jeśli nie ma obfitego uwalniania plwociny, analizę można wykonać biorąc śluz za pomocą bronchoskopii.

Korzyści

W tej metodzie masa plusów obejmuje:

1. Wysoka specyficzność i wrażliwość. Wykryto tylko czynnik wywołujący gruźlicę. Nie ma fałszywej odpowiedzi, jeśli uwzględni się wszystkie niuanse procedury. Mykobakterie są wykrywane nawet wtedy, gdy ich minimalna liczba. Nawet jeśli w zebranym materiale jest 10 nieprawidłowych komórek, infekcja zostanie wykryta.
2. Szybkość uzyskiwania odpowiedzi. Jaka jest analiza? Po 3-5 godzinach możesz uzyskać wynik. Nie ma potrzeby wykonywania hodowli plwociny na gruźlicę, a to skraca czas.
3. Możesz zidentyfikować się jako ukryta infekcja i ta, która jest w ostrej formie.
4. Nie ma bezwzględnych przeciwwskazań. Umożliwia to przeprowadzenie procedury dla wszystkich bez wyjątku (nawet dla małych dzieci), a zwłaszcza gdy inne metody są nierozwiązane.
5. Przy pomocy diagnostyki PCR badane są różne biomateriały (mocz, kał, krew, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy itp.).
6. Metoda ujawnia gruźlicę we wczesnych stadiach, w pierwszych godzinach po zakażeniu.

do treści ↑

Wady

Oprócz pozytywnych stron są też negatywne. To jest:

1. Analiza PCR jest kosztowną „przyjemnością”. Ponadto sprzęt niezbędny do jego wdrożenia nie jest dostępny w każdym ośrodku medycznym. W klinikach jest rzadko obecny, ponieważ jego wartość jest również świetna. Jeśli mówimy o prywatnych klinikach, to tak, można znaleźć tego rodzaju diagnozę. Pozwól sobie, niestety, nie każdy może.
2. Wykazuje fałszywie dodatni wynik u osób, które niedawno przeszły kurs leczenia gruźlicy.
3. Jeśli MBC jest zmutowany, metoda może również dawać fałszywe wyniki.
4. Jeśli materiał jest niepoprawnie zbierany lub specjalista prowadzący badania ma niewystarczający poziom kwalifikacji, możliwe jest również nieprawidłowe działanie. W niektórych przypadkach procedura musi być powtarzana kilka razy i za każdym razem, gdy płatność jest powtarzana.

do treści ↑

Przygotowanie do analizy

Aby materiał był wysokiej jakości, należy go prawidłowo zmontować i odpowiednio przygotować.

Istnieją pewne zasady zbierania plwociny na gruźlicę. Algorytm działania jest następujący:

1. Nawet w przeddzień wieczorem osoba musi wypić środek wykrztuśny (jeśli plwocina słabo się odsunie). Nawet jeśli to nie pomogło, inhalacja powinna być przeprowadzona na podstawie leku rozcieńczającego i wykrztuśnego. W przypadku braku plwociny pacjent jest skierowany na bronchoskopię. Podczas tej procedury pobierany jest materiał do badania.
2. Zakup specjalnego pojemnika z wyprzedzeniem. Jest sterylny i hermetyczny, więc nie można w nim umieszczać niczego dodatkowego, a także otwierać z wyprzedzeniem.
3. Pomieszczenie, w którym zostanie pobrana plwocina, powinno być dobrze wentylowane. Należy otworzyć okna, drzwi, włączyć kaptur. Inną dobrą opcją jest zdobycie świeżego powietrza (na przykład na balkon lub na dziedziniec).
4. Tuż przed procedurą musisz ostrzec wszystkich, aby nikt nie wszedł do pokoju, w którym wszystko się wydarzy. W materiale biologicznym nie powinno być żadnych dodatkowych mikrocząstek - to ważne.
5. Jedzenie przed zbieraniem nie jest zalecane.
6. Wypłukać usta i gardło.
7. Ślina jest wypluwana. Jego pojemność powinna być minimalna.
8. Kaszląc, osoba wyciąga flegmę i wypluwa ją do przygotowanego pojemnika. Po zabiegu zamknij szczelnie pokrywkę i zabierz próbkę do laboratorium.

Jak zbierać plwocinę należy poinformować lekarza. Jeśli pacjent nie odważy się zrobić tego samodzielnie, pracownicy służby zdrowia przychodzą na ratunek. Podczas manipulacji zakładają specjalną maskę ochronną. Zbieraj plwociny w specjalnym pomieszczeniu, w którym nie ma możliwości dla obcych. Jeśli pacjent nie może przyjść do kliniki, specjalista przychodzi do jego domu i pomaga zbierać śluz.

Jeśli wykonano bronchoskopię, pacjent jest wstrzykiwany do tchawicy za pomocą urządzenia - bronchoskopu. Z jego pomocą materiał jest pobierany.

Dla niezawodności wskazane jest trzykrotne przekazanie analizy, a mianowicie:

• rano na czczo;
• po raz pierwszy po 4-5 godzinach;
• 24 godziny po pierwszym badaniu, a także przed posiłkami.

do treści ↑

Jak ta analiza została wykonana?

Przepuszczenie testu plwociny na gruźlicę to tylko część pracy Głównie do przodu. Wiele zależy od przygotowania specjalisty.

Przebieg badania jest następujący:

1. Specjalista przystępuje do zniszczenia pierwotnej struktury DNA (denaturacja). Są tu dwa łańcuchy. W wysokich temperaturach są rozdzielone.
2. W następnym etapie temperatura jest zmniejszana (wyżarzana). Jest to konieczne do połączenia nici DNA ze starterem.
3. Trzeci etap to wydłużenie. Tutaj syntetyzowane są niezbędne cząsteczki.

do treści ↑

Wyniki dekodowania

Mycobacterium tuberculosis w plwocinie metodą PCR można wykryć lub nie. Pozytywny wynik opiera się na fakcie, że w biomateriałach znajduje się DNA pałeczek Kocha. Sugeruje to, że osoba jest zainfekowana. Z negatywem - 98% faktu, że obiekt nie jest zainfekowany.

Wskaźniki można oceniać na podstawie:

• jaka faza patologii (ukryta lub aktywna);
• jak bardzo wpływa na ciało;
• czy wybrany zabieg jest skuteczny w konkretnym przypadku.

Pamiętaj, że nic nie jest dokładne. Dlatego może wystąpić fałszywie dodatni lub fałszywie ujemny wynik. Aby zapewnić jego poprawność, zaleca się inne procedury diagnostyczne lub PCR przeprowadza się dwukrotnie (trzy razy).

Analiza kosztów w różnych ośrodkach

Możesz dać plwocinę do PCR w różnych klinikach. Podajmy przykłady kilku popularnych centrów Moskwy z polityką cenową.

Metody badania plwociny na gruźlicę

Analiza plwociny dla gruźlicy jest zawarta w zestawie środków diagnostycznych wymaganych do identyfikacji i wyjaśnienia diagnozy. Zawartość plwociny pomoże stworzyć właściwy schemat leczenia.

Jak przejść test plwociny na gruźlicę

Lekarze opracowali zasady przeprowadzania analizy. Ślina jest zbierana rano, zanim osoba zje śniadanie. Po pierwsze, pacjent wykonuje procedury higieniczne:

• czyszczenie szkliwa zębów;
• dokładne płukanie czystą wodą jamy ustnej i gardła.

Następnie rozpoczyna się natychmiastowa dostawa materiału do analizy. Jak przejść test plwociny? Wymagania dotyczące procedury:

1. Przygotowanie rozpoczyna się wcześniej, wieczorem. Pacjent jest zachęcany do przyjmowania specjalnych leków, które sprawią, że wydzielanie płuc stanie się bardziej naturalne. Są to związki wykrztuśne i przerzedzające. Jeśli takie procedury nie pomogą, należy wykonać inhalację kompozycją farmaceutyczną do odkrztuszania.
2. Przygotuj pojemniki na plwocinę. Śluz należy zbierać w sterylnych naczyniach, szczelnie zamykając.
3. Przed dostawą kaszlnij i pluj do pojemnika. Objętość śliny nie powinna być duża, wymaga plwociny z krtani. Bakterie w jamie ustnej są obce w analizie.
4. Zbierz ślinę w pomieszczeniu o doskonałej wentylacji. Analiza jest przeprowadzana przez otwarcie pawęży, z kapturem. Zaleca się otwieranie okien lub wyjście na świeże powietrze.

Podczas procedury w pokoju zabronione jest wejście. Osoby z zewnątrz mogą przyczyniać się do rozwoju mikroflory biura, a tym samym do plwociny, formacji patologicznych. Pracownicy medyczni otrzymują analizę w specjalnej masce (respirator).

Analiza plwociny dla transkrypcji gruźlicy

Dekodowanie zaczyna się od spojrzenia na wygląd śluzu. Patologia charakteryzuje zmianę koloru - staje się ciemna, z widocznymi domieszkami krwi. Kolor nie jest głównym wskaźnikiem. Plwocina staje się ciemna od picia czerwonego wina, pasji kawy. Niektóre narkotyki i kolorowe napoje zmieniają wygląd śluzu.

Zebrany materiał jest odszyfrowywany przez dwa wskaźniki, tzn. Lekarze uzyskują dwa wyniki:

Pozytywna odpowiedź

Analiza powstałej plwociny potwierdza obecność choroby w organizmie. Co to potwierdza:

• ciała obce lub nieznane wtrącenia;
• obecność skrzepów śluzu;
• widoczne smugi;
• nieprzyjemny zapach ropny lub zakaźny;
• ropa.

Metoda badań makroskopowych dostarcza innych danych:

• włókniste zwoje;
• Formacje różdżki Kocha;
• produkty z rozkładu rozkładu substancji bakteryjnych;
• pozostałości procesu patologicznego w tkance płucnej.

Pozytywny wynik ujawnia zwiększoną ilość związków białkowych. Osiąga 100-120 g / l.

Inna metoda mikroskopowa umożliwia identyfikację innych niebezpiecznych elementów:

• makrofagi pęcherzykowe;
• zawyżony skład leukocytów;
• wysoki wskaźnik limfocytów.

W przypadku gruźlicy osoba często próbuje wypluć się z ust. Krwioplucie zwiększa tworzenie czerwonych krwinek. Objętość śliny w ustach jest taka, że ​​osoba nie może jej połknąć bez zauważenia. To więcej niż w zdrowym stanie.

Odpowiedź negatywna

Badanie pokazuje, że liczba leukocytów jest mała, odpowiada normie. Nie wykryto także bakterii. Jeśli pacjent nie czuje się zdrowy, specjalista przepisze dodatkowe badanie. Możliwe, że choroba jest związana z chorobą płuc. Rodzaje i metody dodatkowej diagnostyki zależą od objawów i stanu pacjenta.

Jak się bada śluz

Gruźlica jest niebezpiecznym efektem patologicznym na tkankę płucną, obserwuje się ich rozpad. Analizę przeprowadza się kilkoma metodami. Najbardziej powszechny - test ELISA (test immunologiczny). Istota metody:

1. Przeciwciała dodaje się do roztworu, w którym umieszcza się część plwociny.
2. Sprawdź stężenie antygenów w porównaniu z normą zdrowego ciała.
3. Określ aktywność środowiska patologicznego.
4. Diagnozuj.

Druga wersja badań laboratoryjnych to ODPADY. Do metody należy stosować specjalny sprzęt medyczny. Istota badań sprzętu:

1. W plwocinie wstrzyknięto mikrośrodowisko dla zamierzonego rodzaju zakażenia.
2. Aparat zaczyna rosnąć w określonych temperaturach szczepów bakterii.
3. W procesie powstaje dwutlenek węgla, a czujniki go wychwytują.
4. Gaz łączy się z barwnikiem.
5. Na wskaźniku fluorescencji wyciągnij wnioski na temat rodzaju choroby.

Najłatwiej jest kulturowo. Flegma posiana w specjalnym środowisku. Lekarz bada rodzaje kolonii formacji mikrobiologicznych. Metoda jest najdłuższa, ale pozwala udowodnić diagnozę. Jest stosowany bardzo rzadko, właśnie ze względu na długi okres czasu, który nie zawsze jest odpowiedni dla pacjenta.

Analiza pcr plwociny na gruźlicę

PCR jest skrótem medycznego terminu reakcja łańcuchowa polimerazy. Diagnostyka jest jednym z najnowszych osiągnięć naukowców. Został otwarty w 1983 roku, znaczenie odkrycia jest doceniane na świecie, naukowiec otrzymał najwyższe uznanie - Nagrodę Nobla.

Metoda opiera się na wykorzystaniu inżynierii genetycznej. Jego wszechstronność wymaga niewielkiej ilości materiału do dokładnej diagnozy. Rozpoznanie zakażenia gruźlicą jest naprawdę we wczesnych godzinach infekcji, nie czekając na rozwój choroby.

Istota metody polimerazy:

• pacjent pobiera fragment cząstek DNA;
• przeprowadzić biologiczną syntezę materiału;
• określona przez klasę mikroorganizmów.

Proces jest skomplikowany technologicznie, obejmuje molekularne badanie genetyczne. PCR na gruźlicę trwa dosłownie kilka godzin. Czasu potrzebnego na inne metody nie można porównać z szybkością. Po zakończeniu analizy pacjent czeka na wykrycie czynnika sprawczego. Proces, który leży u podstaw tylko specjalisty, może to zrozumieć. Zwykła osoba nie rozumie zawiłości metody.

Jak diagnozuje się testy gruźlicy:

1. Weź niezbędny materiał do analizy. Co to może być: krew, żołądek, plwocina, woda, przemyte oskrzelami.
2. Rodzaj materiału jest wybierany w zależności od rodzaju możliwego zakażenia patogenem.
3. Następnym krokiem jest zbadanie połączenia łańcucha. Dwa łańcuchy poddawane są działaniu wysokich temperatur do 98 stopni. Etap nazywany jest denaturacją (zniszczenie strukturalnego łańcucha DNA). Czas ekspozycji na temperaturę - do 2 minut.
4. Następnym etapem jest wyżarzanie. Temperatura jest zmniejszona, starter może połączyć się z nicią DNA.
5. W rezultacie zachodzi wydłużenie - synteza cząsteczek niezbędnych do procesu.

Do takiej analizy wymagany jest specjalny sprzęt. Jest kosztowna, więc nie jest dostępna w żadnym zakładzie opieki zdrowotnej. PCR przeprowadza się w trudnych przypadkach, gdy nie ma dokładnego wyniku konwencjonalnych metod diagnostycznych, niemożliwe jest przeprowadzenie instrumentalnych metod sprawdzania stanu pacjenta.

Zalety technologii PCR:

1. Szybkość wyniku. Około 5 godzin lekarz ma dokładne dane. Ta prędkość pozwala pomóc pacjentowi w nagłym wypadku. Częściej jest to okres przedoperacyjny.
2. Dozwolone, gdy nie można użyć innych metod. Na przykład częste powtarzanie promieni rentgenowskich prowadzi do promieniowania. PCR nie jest niebezpieczna dla pacjenta.
3. Możesz odkrywać każde środowisko biologiczne. Zidentyfikowano nawet złożone formy gruźlicy.
4. Metoda jest więc bezpieczna dla dzieci.
5. Infekcja jest wykrywana na każdym etapie.
6. PCR nie pozwala ukryć nawet niewielkiej liczby mikroformacji bakteryjnych.
7. Nadaje się do sprawdzania ewentualnego nawrotu gruźlicy.

Ile analiz plwociny w gruźlicy

Próbki pobiera się więcej niż jeden raz. Powtórzenia wykluczają możliwość błędów lub uzyskania materiału niskiej jakości, który nie odzwierciedla prawdziwej pozycji i stanu pacjenta. Ile razy należy zebrać plwocinę, powiadomić lekarza prowadzącego. Najlepszą opcją jest trzy razy dziennie. Czasami mogą być wymagane dodatkowe próbki. W jakich okresach zbierają:

1. Przed jedzeniem rano.
2. 3-4 godziny po pierwszym teście.
3. Drugiego dnia, także przed posiłkami.

Gruźlica jest niebezpieczną chorobą, która może wpływać na ciało każdej osoby. Istnieje wiele sytuacji infekcji. W przypadku podejrzenia możliwości zakażenia nie czekaj na jasne objawy. Powinien być testowany, badany i na czas, aby rozpocząć leczenie.

Diagnostyka PCR gruźlicy u dzieci i dorosłych: wskazania do

Światowa Organizacja Zdrowia uznała 20 lat temu, że tempo rozprzestrzeniania się gruźlicy wymknęło się spod kontroli i osiągnęło skalę epidemii. Od tego czasu sytuacja nie uległa poprawie. Każdego roku diagnozuje się ponad milion przypadków choroby, z czego prawie jedna czwarta jest śmiertelna. W ostatnim dziesięcioleciu częstość występowania wśród dzieci wzrosła, większość form choroby nie poddaje się standardowej terapii antybiotykowej.

Obecnie jednym z globalnych zadań medycyny jest opracowanie takich metod diagnostycznych, które pozwolą na identyfikację patologii przed wystąpieniem wyraźnych objawów klinicznych. Jedną z nich jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) na gruźlicę, która pomaga wykryć pałeczki powodujące chorobę Kocha we krwi, plwocinie i innych płynach biologicznych.

Diagnoza gruźlicy

Testy przesiewowe mają na celu wykrycie pacjentów, nosicieli gruźlicy i zapobieganie rozprzestrzenianiu się infekcji w społeczeństwie. Dla dzieci poniżej 14 roku życia stosuje się test Mantoux. Jest to test immunologiczny, w którym wstrzykuje się podskórnie dawkę tuberkuliny - złożoną mieszaninę materiału genetycznego kilku rodzajów prątków. Pojawienie się wyraźnej reakcji wskazuje na aktywnie występujący proces zakaźny.

Do badań profilaktycznych u dorosłych za pomocą fluorografii lub prześwietlenia rentgenowskiego. Metody te pomagają uwidocznić patologiczne zmiany w tkance płucnej. Jednak powoduje trudności w odróżnieniu gruźlicy od innej patologii organicznej (nowotwory złośliwe i łagodne, procesy zapalne, inwazje pasożytnicze, profesjonalne uszkodzenie płuc).

Aby wyjaśnić strukturę i rozmiar patologicznej ostrości, mogą być potrzebne dodatkowe badania instrumentalne:

• radiografia ukierunkowana;
• tomografia komputerowa;
• rezonans magnetyczny.

Metody diagnozowania gruźlicy

W przypadku wątpliwych wyników i wyznaczenia odpowiedniej terapii istnieje potrzeba dokładniejszych metod diagnostycznych, które umożliwią wyizolowanie patogenu. Badanie mikroskopowe i bakteriologiczne plwociny jest stosowane do potwierdzenia przez długi czas postaci płucnych gruźlicy.

W ostatnich latach częstość występowania prątków różnych narządów i układów - nerek, kości, jelit, skóry - stała się częstsza. Aby zidentyfikować te formy gruźlicy, badania ultrasonograficzne, kulturę moczu i kału, można zastosować badania endoskopowe.

Diagnostyka PCR dla gruźlicy pomoże potwierdzić obecność pałeczek Kocha we krwi, a także jego wrażliwość na niektóre leki. Jest to wysoce skuteczna metoda oparta na wykrywaniu bakteryjnego materiału genetycznego w różnych płynach biologicznych.

Specyfika i wskazania

Reakcja łańcuchowa polimerazy jest wysoce czułą metodą diagnostyki mikrobiologicznej, która opiera się na zasadach inżynierii genetycznej. Aby potwierdzić obecność patogenu w materiale biologicznym, wystarczy wykryć dla niego unikalny fragment kwasu nukleinowego. PCR na gruźlicę może wykryć bakterie we krwi, plwocinie, moczu.

W tej chwili opracowałem kilka metod analizy. Najpopularniejsze z nich to:

• PCR w czasie rzeczywistym;
• technologia mikroprzepływowa;
• sekwencjonowanie i pirosekwencjonowanie.

PCR w czasie rzeczywistym

Laboratoria najczęściej wykorzystują reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym, ponieważ zmniejsza to liczbę wyników fałszywie dodatnich, a sam proces analizy zajmuje krótki czas.

Biorąc pod uwagę dużą liczbę ukrytych form choroby i nieskuteczność standardowych metod diagnostycznych, coraz częściej stosuje się PCR. Celem tej analizy jest:

• identyfikowanie podejrzanych obszarów na zdjęciu rentgenowskim;
• wątpliwe wyniki testu tuberkulinowego;
• niemożność przeprowadzenia analizy mikroskopowej i bakteriologicznej plwociny u osób w ciężkim stanie;
• prowadzenie interwencji chirurgicznych, gdy konieczne jest szybkie zapewnienie, że nie ma infekcji;
• niedopuszczalność stosowania fluorografii, promieni rentgenowskich lub tomografii komputerowej (na przykład u kobiet w ciąży i karmiących piersią, w przypadku nadmiernej ekspozycji na promieniowanie);
• podejrzewana gruźlica pozapłucna (zaleca się stosowanie nie tylko krwi, ale także flegmy).

Diagnostyka PCR gruźlicy sprawdziła się w badaniu dzieci ze względu na brak dodatkowej ekspozycji i szybkie wyniki.

Procedura przygotowania i analizy

Specjalne przygotowanie do PCR krwi nie jest wymagane. Jednak w celu uniknięcia komplikacji pobierania próbek krwi oraz w celu uzyskania materiałów wysokiej jakości, należy przestrzegać następujących zasad ogólnych:

• analizę należy wykonać rano nie wcześniej niż 2 godziny po przebudzeniu;
• Powinien ograniczać spożycie tłustych i smażonych potraw na dzień przed pobraniem krwi;
• powstrzymać się od jedzenia, herbaty i kawy przez 8-9 godzin, wolno pić czystą wodę;
• Nie palić przez co najmniej 3-4 godziny.

W przypadku leków stałych (hormonów, leków przeciwzakrzepowych, leków przeciwzapalnych, antybiotyków, leków rozrzedzających krew) powinieneś powiadomić o tym asystenta laboratoryjnego.

Po dostarczeniu plwociny powinieneś dobrze umyć zęby i przepłukać usta kilka razy. Zebrać materiał w sterylnym pojemniku. Dla uzyskania lepszych wyników wieczorem można zastosować środek wykrztuśny lub mukolityczny.

Sama diagnoza składa się z kilku etapów.

Materiał ogrodzeniowy. Może być wykonywany w laboratorium i zdalnie. Niektóre rodzaje materiału, które pacjent zbiera niezależnie (mocz, flegma).

Zniszczenie struktury kwasów nukleinowych (denaturacja cząsteczek DNA i RNA). W tym celu badany materiał ogrzewa się do temperatury 98 stopni i utrzymuje przez kilka minut. W rezultacie podwójna helisa odwija ​​się, tworzą się jednoniciowe cząsteczki.

Wyżarzanie Po dodaniu startera (krótki odcinek kwasu nukleinowego) temperatura spada o kilka stopni, aktywuje się polimeraza.

Poznanie. Temperaturę doprowadza się do optymalnego poziomu, aktywność enzymu osiąga maksimum, a drugi łańcuch kończy się zgodnie z zasadą komplementarności Chargaffa.

Aby zakończyć badanie, konieczne jest zsyntetyzowanie wymaganej liczby cząsteczek DNA - około 50 cykli powyższej reakcji. To trwa około 2-3 godzin. Pozytywny wynik reakcji nie zawsze wskazuje na aktywny etap choroby, ale jest wskaźnikiem obecności mikroorganizmu w organizmie.

Zalety i wady tej metody

W porównaniu z innymi metodami mikrobiologicznymi, PCR nie zajmuje dużo czasu, aby wykryć Mycobacterium tuberculosis za pomocą PCR, wynik można uzyskać w dniu badania.

Kolejną zaletą jest wysoka specyficzność analizy, która umożliwia wykrycie obecności patogenu z dokładnością 90-95% w prawie każdym biomateriałie (krew, mocz, kał, płyn mózgowo-rdzeniowy, plwocina, uderzenia oskrzeli).

Istnieje jednak kilka wad tej metody:

• dość wysoki odsetek wyników fałszywie dodatnich (do 15%), co jest związane z wykrywaniem nieożywionych mikroorganizmów;
• w niektórych przypadkach można pominąć fakt choroby, ponieważ Mycobacterium tuberculosis jest często poddawana mutacjom i jej zmianom materiału genetycznego;
• niska skuteczność w badaniu osób z niedoborem odporności;
• wysoki koszt badań, potrzeba drogiego sprzętu i odczynników.

Co można wymienić?

Biorąc pod uwagę różnorodność form zakażenia gruźlicą, dla dokładniejszej diagnozy i wyboru leczenia konieczne jest połączenie kilku badań diagnostycznych:

Obowiązkowa analiza dla dzieci to test Mantoux. Jeśli wprowadzenie tuberkuliny (materiału genetycznego mykobakterii) nastąpi wyraźna reakcja, można przypuszczać, że zakażenie prątkiem gruźlicy.

Metody rentgenowskie można wykorzystać do wizualizacji patologicznej ostrości. W diagnostyce gruźlicy pozapłucnej stosuje się metody endoskopowe z jednoczesną biopsją:

• bronchoskopia pomaga zidentyfikować zmiany w krtani, tchawicy, oskrzelach;
• kolonoskopia - jelita;
• cystouretroskopia - narządy układu moczowego;
• histeroskopia - żeńskie narządy płciowe. Metody te nie są specyficzne, aby dokonać dokładnej diagnozy, należy zidentyfikować patogen.

Ogólne testy kliniczne pomogą dokładniej określić stan organizmu. Wymagana jest pełna morfologia krwi z formułą leukocytów.

Wzrost liczby neutrofili o obniżonym poziomie limfocytów i wzrost szybkości sedymentacji erytrocytów (ESR) wskazuje na aktywny proces zapalny o etiologii bakteryjnej. Aby wykluczyć uszkodzenie narządów układu moczowego, stosując ogólną analizę moczu i kulturę do sterylności.

PCR jest obecnie dostępny w większości prywatnych laboratoriów. Wymaga to nie tylko wysoko wykwalifikowanych specjalistów, ale także drogiego sprzętu, dużej liczby odczynników. Dlatego stosowanie tej metody jest ograniczone pomimo jej wysokiej dokładności i specyficzności.

Zalety i wady PCR (a) w diagnostyce gruźlicy

Specyficzne zakażenie gruźlicą jest obecne w ludzkich tkankach i strukturach przez wiele lat, aw pewnych okolicznościach szybko rozprzestrzenia się w organizmie w ciągu 2-3 miesięcy. Czasami najlepszy sposób leczenia jest bardzo trudny do wyboru z powodu późnej diagnozy i adaptacji patogenu do wielu leków.

Najnowsza diagnoza gruźlicy PCR pomaga wykryć nie tylko rozwiniętą chorobę, ale także sam patogen, gdy pierwsze objawy choroby jeszcze się nie pojawiły.

Czym jest PCR?

Niedawno pojawiła się diagnoza gruźlicy metodą PCR. W 1983 r. Mikrobiolog z Ameryki, Cary Mullis, wynalazł procedurę, dzięki której mikroorganizmy można odtworzyć z materiału biologicznego w krótkim segmencie. Ta praca zdobyła Nagrodę Nobla.

PCR dla gruźlicy jest procesem łańcuchowym polimeru, w którym diagnostyka i wykrywanie patogenów wirusowych za pomocą inżynierii genetycznej. Technika jest stosowana w laboratoriach immunologicznych, mikrobiologicznych, wirusologicznych i biochemicznych.

Uniwersalna metoda pomaga lekarzom diagnozować i identyfikować proces zakaźny nawet po pierwszych godzinach infekcji, na długo przed wystąpieniem objawów. Badania są możliwe nawet przy niewielkiej ilości biomateriału.

Co jest potrzebne do analizy?

• Kilka segmentów DNA (starterów), z którymi rozpoczyna się synteza biologiczna;
• Związki nukleotydowe, podstawa cząsteczki DNA lub RNA;
• Enzym polimerazy, który przyspiesza analizę PCR.

Jaka jest podstawa metody?

Po pierwsze, odcinek DNA jest ekstrahowany z biomateriału od osoby zakażonej, przy użyciu metod biosyntezy genowo-molekularnej, dalej określa się rodzaj mikroorganizmów, do których należy biofragment.

Ta złożona reakcja zajmuje mniej czasu niż niektóre biometody. PCR określa patogen w ciągu kilku godzin, podczas gdy nie ma potrzeby izolowania go od płynu biologicznego (plwociny, płynu mózgowo-rdzeniowego lub krwi), nie trzeba go długo hodować na pożywce. Wystarczy, że badany materiał zawiera nici DNA zakaźnego patogenu.

Podczas przeprowadzania testu PCR na gruźlicę in vitro synteza kwasów rybonukleinowych mycobacterium tuberculosis jest tworzona sztucznie.

Etapy diagnozy

Reakcja molekularna metodą PCR to prosta procedura, która zajmuje niewiele czasu. Wymagany biomateriał jest pobierany: krew, plwocina, płyn do przemywania oskrzeli są używane do określenia tbc.

1. Najpierw niszczona jest podstawowa forma DNA, 2 łańcuchy są rozdzielane w wysokiej temperaturze (maksymalnie 98 ° C przez nie więcej niż 2 minuty);
2. Następnie przeprowadza się wyżarzanie, temperaturę pierwotną zmniejsza się o kilka podziałów, nić DNA łączy się ze starterem;
3. Następny etap nazywa się wydłużeniem, z biosyntezą niezbędnych struktur molekularnych.

Aby uzyskać wymaganą liczbę kopii DNA, musi minąć od 25 do 30 takich cykli, a wynikowa liczba prątków jest łatwo rozpoznawalna.

Czy konieczne jest wykonanie PCR dla gruźlicy?

Bezpośrednio dla wszystkich pacjentów z podejrzeniem TVC nie przeprowadza się diagnostyki łańcuchowej, ponieważ procedura wymaga użycia drogiego sprzętu. Nie wszystkie państwowe instytucje medyczne zezwalają na jego zakup, zwłaszcza że zwykłe metody diagnozowania prątków gruźlicy są również pouczające.

• Ostrożne pobieranie historii, przesłuchanie pacjenta;
• Badanie zewnętrzne;
• Test tuberkulinowy Mantoux;
• Badanie radiograficzne lub fluorograficzne;
• W razie potrzeby diagnostyka komputerowa;
• Badanie mikroskopowe lub bakteriologiczne maski za pomocą plwociny.

PCR dla gruźlicy przeprowadza się tylko wtedy, gdy nie jest możliwe przeprowadzenie innej analizy instrumentalnej lub w okolicznościach trudnych do rozpoznania.

Pomimo wynalezienia dużej liczby metod diagnostycznych, liczba pacjentów z gruźlicą stale rośnie. Ponadto częstość występowania nabrała pewnych cech: często obserwuje się ciężką postać choroby, zwiększa się liczba zgonów, patogen staje się odporny na istniejące leki chemioterapeutyczne.

Wiele osób nie chce co roku poddawać się rutynowej kontroli, odmawia szczepienia, co prowadzi do zwiększenia częstości występowania. Takie okoliczności wymagają skutecznych i pouczających metod badawczych dostępnych dla dorosłych i dzieci, u których zdiagnozowano tbc. PCR ma przewagę nad innymi metodami diagnostycznymi.

Jaka jest wartość metody?

Ostatnie badania dobrze się sprawdziły. Jeśli z wielu powodów trudno jest postawić diagnozę lub, w niektórych kontrowersyjnych przypadkach, PCR łatwiej wykrywa prątek gruźlicy w materiale biologicznym niż inne metody.

• To szybkie badanie, mały segment cząsteczki, umożliwia dokonanie dokładnej diagnozy w krótkim czasie po około 5 godzinach, jest to stosowane w nagłych przypadkach, na przykład przed pilną interwencją chirurgiczną;
• Badanie krwi na gruźlicę jest możliwe, gdy inne metody są niedostępne lub przeciwwskazane - czasami w celu wykrycia patogenu do potwierdzenia, trzeba wziąć wiele strzałów Rg, dawka promieniowania jest zbyt duża;
• Za pomocą reakcji polimerazy można badać wszelkie płyny biologiczne pod kątem obecności prątków. Na przykład można przeprowadzić badanie płynu mózgowo-rdzeniowego z gruźliczym zapaleniem opon mózgowych lub moczem z gruźlicą układu moczowo-płciowego;
• Metoda jest bezpieczna, diagnoza gruźlicy u dzieci za pomocą PCR nie powoduje trudności;
• Metoda reakcji polimeru ujawnia prątek gruźlicy w dowolnej postaci i stadium choroby;
• Obecność tylko kilku bakterii w biomateriałach pozwala zobaczyć obecność mikroorganizmów, ponieważ jest to wrażliwa reakcja;
• PCR łatwo diagnozuje nawrót choroby.

Pomimo ogromnej liczby korzyści, wszyscy pacjenci z podejrzeniem badania tbc nie są przeprowadzani, ponieważ istnieją również wady, są one również brane pod uwagę.

Wideo

Wideo - wczesna diagnoza

Jakie są wady?

Ta metoda diagnozy jest raczej wyjątkowa niż naturalna, ponieważ istnieją ku temu powody. Przede wszystkim uwzględnia się wysoki koszt metody. Sprzęt jest drogi, kliniki publiczne nie mają możliwości jego zakupu ze względu na wysoką cenę, ale większość płatnych laboratoriów ma sprzęt, który jest analizowany.

• Metoda wykrywa martwe bakterie, które zmarły po leczeniu, podczas gdy PCR wykazuje wynik pozytywny. Bezpośrednio po chemioterapii nie ma sensu przeprowadzanie badań, ponieważ wynik będzie niewiarygodny;
• Mutacje Mycobacterium tuberculosis są podatne, co prowadzi do nieskuteczności metody, a nici DNA nie można syntetyzować konsekwentnie.

Środowisko do badań powinno być starannie wybrane, krew lub mocz mogą być zbierane tylko wtedy, gdy istnieje podejrzenie zakażenia. Plwociny nie należy przyjmować do badania, jeśli podejrzewa się gruźlicę kości. W tej sytuacji diagnoza będzie nieprawidłowa.

Rzadko pobiera się krew i mocz pacjenta z gruźlicą, który ma być badany metodą PCR, identyfikacja choroby w ten sposób jest wątpliwa. W tych pożywkach biologicznych patogen jest określany tylko w posocznicy lub w przypadku rozsianej gruźlicy. Najczęściej występują lokalne formy, których krew i mocz mogą pozostać niezmienione. Najczęściej flegma jest pobierana do badania.

Kto pokazuje analizę?

Większość pacjentów wysyła się do diagnostyki PCR w kontrowersyjnych i trudnych przypadkach gruźlicy. Kiedy lekarze wydają skierowania na badania?

1. Jeśli istnieje kontakt z osobą, u której zdiagnozowano gruźlicę, ale trudno jest zdiagnozować ją konwencjonalnymi metodami;
2. W takich okolicznościach, jeśli pacjent nie jest w stanie zapewnić kliniki w radiografii lub innych badaniach. W takiej sytuacji łatwiej jest to sprawdzić za pomocą metody polimerowej. Analiza plwociny jest po prostu dostarczana do laboratorium w specjalnym pojemniku, a wynik staje się znany po kilku godzinach;
3. Przed operacją należy pilnie ustalić, czy pacjent jest chory na gruźlicę, w którym to przypadku wskazano PCR;
4. Ze względu na bezpieczeństwo metody możliwe jest przeprowadzenie badania kobiety w ciąży lub dziecka, bez tworzenia dodatkowego obciążenia rentgenowskiego;
5. Wątpliwe wyniki testu Mantoux.

Każdy, kto chce, może zostać zbadany za opłatą, jeśli gruźlica nie została potwierdzona za pomocą bakteriologii i fluoroskopii. Dzieje się tak, jeśli zmiana w tkance płucnej jest niewidoczna w obrazie Rg w bezpośredniej projekcji, a pacjent nie jest w stanie prawidłowo zebrać plwociny, ale objawy ludzkiej gruźlicy są zaburzone.

Współczesna reakcja PCR w diagnostyce jest kluczem do skutecznego leczenia, w wyniku czego zmniejsza się częstość występowania choroby. Tradycyjne metody identyfikacji dolegliwości nie zawsze przynoszą pożądany efekt.

Tak więc analiza PCR do tej pory stała się jedną z niezawodnych i bezpiecznych metod diagnozowania we wczesnych stadiach choroby.